Makalah Spektrofotometer

SPEKTROFOTOMETER

OLEH KELOMPOK 5 :

1.    NI MADE RATIH DWI MARLINI                              (P07134015028)

2.    DYAH DEVIYANTI                                                   (P07134015032)

3.    REBECA VALENTIANA                                           (P07134015035)

4.    NI WAYAN EKA SUCITAWATI                                  (P07134015042)

5.    SRI LESTARI                                                            (P07134015052)

6.    NI MADE DWI KARTIKA LARASUCI                       (P07134015055)

PRODI D III JURUSAN ANALIS KESEHATAN

POLITEKNIK KESEHATAN DENPASAR

TAHUN AKADEMIK 2015/2016

1. Pengertian Spektrofotometri

Spektrofotometri merupakan salah satu jenis teknik dari spektroskopi yang mempelajari tentang absorpsi dan emisi radiasi dari suatu senyawa. Radiasi tersebut didasarkan atas gelombang elektromagnetik dengan kecepatan  m/detik. Gelombang elektromagnetik tersebut dapat diketahui panjang gelombangnya dari spektrum sinar yang dibiaskan. Spektrum-spektrum tersebut dibagi menjadi dua yakni cahaya tampak dan cahaya tak tampak. Dengan adanya spektrum inilah, maka dapat digunakan untuk menganalisa suatu senyawa atau mikrobia dalam dalam sejumlah penelitian. Alat yang bertindak untuk spektrofotometri disebut spektrofotometer.

Spektrofotometer merupakan alat yang digunakan untuk mengukur absorbani dengan cara melewatkan cahaya dengan panjang gelombang tertentu pada suatu obyek kaca atau yang disebut kuvet. Sebagian dari cahaya tersebut akan diserap dan sisanya akan dilewatkan. Nilai absorbansi dari cahaya yang dilewatkan akan sebanding dengan konsentrasi larutan di dalam kuvet.

Analisis kimia dengan metode spektrofotometri didasarkan pada interaksi radiasi elektromagnetik (sinar) dengan materi. Interaksi tersebut meliputi proses absorpsi, emisi, refleksi dan transmisi radiasi elektromagnetik oleh atom-atom atau molekul dalam suatu materi.

Spektroskopi berhubungan dengan pengukuran dan interpretasi radiasi elektromagnetik yang diserap atau diemisikan ketika molekul, atom, atau ion dari suatu sampel bergerak dari satu tingkat energi tertentu ke tingkat energi lainnya. Setiap atom, ion, atau molekul mempunyai hubungan khas dengan radiasi elektromagnetik. Spektroskopi bisa berkaitan dengan perubahan energi rotasi, energi vibrasi ataupun energi elektronik sebagai akibat penyerapan radiasi.

A.   Cahaya dan Sifat-Sifatnya

Cahaya adalah suatu bentuk energi dan merupakan radiasi elektromagnetik. Bagian kecil dari radiasi elektromagnetik adalah cahaya tampak yang dapat dilihat langsung oleh mata. Cahaya dapat dikatakan sebagai rangsangan yang diterima oleh panca indra mata. Dalam menerima rangsangan tersebut ada keterbatasan pada diri manusia yaitu hanya dapat mengidentifikasi cahaya pada panjang gelombang 380-780 nm, yang dikenal sebagai cahaya tampak ( visible light).

Tabel panjang gelombang warna dan warna komplementer

Panjang Gelombang (nm)	Warna	Warna Komplementer
< 380	UV
380 – 435	Violet	Hijau Kekuningan
435 – 480	Biru	Kuning
480 – 490	Biru Kehijauan	Jingga
490 – 500	Hijau Kebiruan	Merah
500 – 560	Hijau	Ungu Kemerahan
560 – 580	Hijau Kekuningan	Violet
580 – 595	Kuning	Biru
595 – 650	Jingga	Biru Kehijauan
650 – 780	Merah	Hijau Kebiruan
> 780	Infra Merah

Radiasi elektromagnetik mencakup kisaran panjang gelombang yang sangat besar. Sesuai dengan kisaran panjang gelombangnya, maka energi juga beragam pula. Sinar-x mempunyai energi yang cukup untuk mempengaruhi elektron dalam, sedangkan sinar uv hanya cukup untuk mempengaruhi elektron valensi. Sementara itu radiasi infra merah hanya cukup untuk mempengaruhi vibrasi dan rotasi molekul.

Sinar X memiliki panjang gelombang yang pendek, tetapi berenergi tinggi. Sinar X dapat melalui padatan atau cairan yang tipis. Radiasi sinar X yang terlalu banyak akan merusak sel-sel tubuh manusia. Sinar uv dapat diproduksi oleh lampu khusus yang mengandung uap merkuri atau gas deuterium. Sinar uv berenergi tinggi dan akan menyebakan luka bakar bila terlalu lama mengenai kulit. Sinar tampak diproduksi oleh lampu biasa (misalkan, lampu wolfram). Cahaya putih yang terpancar dari matahari merupakan campuran dari beberapa cahaya berwarna seperti merah, jingga, kuning, biru, nila, dan ungu. Sinar infra merah dihasilkan dari benda panas semacam kawat logam globar dalam bola lampu. Sinar IR tidak terlihat tetapi dapat dirasakan hangat oleh kulit manusia.

1)    Sifat Sinar Tampak

Cahaya putih bila diuraikan akan terdiri dari beberapa warna cahaya, yaitu merah, jingga, kuning, hijau, biru, nila dan ungu. Bila kesemua berkas sinar tersebut digabungkan kembali, amka akan diperoleh cahaya putih kembali.

Warna-warna pada cahaya tampak akan terlihat  bila ada seberkas cahaya putih direfraksikan oleh prisma, oleh karena cahaya tampak terdiri dari beberapa warna cahaya, maka cahaya tampak disebut sebagai cahaya polikromatis. Satu atau beberapa warna dari cahaya tampak dapat dihilangkan antara lain dengan mengabsorpsi warna tersebut. Setelah absorpsi, maka yang terlihat adalah warna sisa yang tidak terabsorpsi. Sebagai contoh, larutan CuSO₄ terlihat berwarna biru, karena larutan meneruskan warna biru dan menyerap cahaya kuning ( hijau dan merah). Warna yang diserap oleh larutan tersebut dinamakan warna komplemennya.

2)    Sifat Sinar Ultra Violet

Sinar ultra violet berenergi tinggi, artinya memiliki panjang gelombang yang pendek. Suatu senyawa dapat menyerap sinar uv bila dalam senyawa tersebut terdapat gugus fungsi yang disebut sebagai kromofor. Kromofor cenderung memiliki ikatan tak jenuh atau mengandung gugus fungsi dengan ikatan rangkap.

Tipe	Contoh	Pita Serapan (nm)
Alkena	CH2CH2	165 – 193
Alkuna	CHCH	195 – 225
Aldehida	CH3CHO	180 – 290
Keton	CH3COCH3	188 – 279
Asam	CH3COOH	208 – 210
Karboksilat		204 - 254

3)    Radiasi Elektromagnetik

Suatu berkas radiasi merupakan gelombang elektromagnetik atau foton yang bergerak dengan kecepatan cahaya. Foton mempunyai sifat partikel dengan energi tertentu dan pada saat yang sama juga mempunyai sifat gelombang. Sebuah foton yang berasal dari suatu titik tertentu dalam ruang bergerak dari titik tersebut dalam bentuk gelombang yang dicirikan dengan vektor medan listrik yang secara berkala mempunyai titik maksimum pada arah tegak lurus terhadap gelombang. Panjang gelombang suatu radiasi dinyatakan dalam Angstrom ( 1 A⁰ = 10^-8 m) atau nanometer ( 1 nm = 10^-7 m).

Radiasi juga mempunyai frekuensi yaitu jumlah gelombang yang melintasi satu titik tertentu selama waktu tertentu. Panjang gelombang dan frekuensi dihubungkan dengan energi foton( E ) menurut persamaan :

E = hc/lamda

            Dimana :        h = Tetapan Planc ( 6,626 x 10^-27 erg per detik )

                                    c = Kecepatan Cahaya ( 3 x 10⁸ m/dtk )

Dari persamaan tersebut tampak bahwa energi radiasi berbeda-beda tergantung pada panjang gelombangnya. Energi semakin kecil dengan semakin besar panjang gelombang radiasi.

Spektra absorpsi sering diyatakan dalam %T maupun dalam bentuk A (absorbansi).

Maka, A = – log (%T)

A = log (P_o/P), P_o adalah daya cahaya masuk dan P adalah daya yang diteruskan melewati sampel.

B.   Interaksi cahaya dengan materi

Banyak instrumen telah dikembangkan untuk keperluan pengukuran secara kuantitatif, diantaranya berdasarkan sifat optik senyawa yang dianalisis. Analisis optik melibatkan interaksi radiasi elektromagnetik dengan bahan-bahan kimia. Dalam analisis ini secara umum parameter pengukuran yang digunakan adalah absorpsi cahaya, hamburan cahaya, emisi cahaya, indeks refraksi suatu zat, rotasi cahaya yang terpolarisasi.

1)    Absorpsi Cahaya

Zat kimia dapat mengabsorpsi cahaya melalui berbagai cara. Bila zat kimia mengabsorpsi cahaya, maka energi cahaya tersebut diubah menjadi bentuk energi lain. Elektron valensi pada atom atau ion dapat mengabsorpsi energi cahaya uv atau visible sehingga menyebabkan elektron pindah ke tingkat energi yang lebih tinggi. Atom hanya dapat mengabsorpsi energi bila energi tersebut setara dengan perbedaan energi dari dua tingkat energi. Kalau energi cahaya tidak cukup memadai dengan tingkat energi atom, maka cahaya hanya akan melewatinya tanpa diabsorpsi. Energi berhubungan dengan panjang gelombang. Oleh karena itu juga berkaitan dengan warna cahaya.

2)    Emisi Cahaya

Jika elektron pada keadaan tereksitasi kembali ke tingkat energi yang lebih rendah kembali, maka akan diemisikan energi dalam bentuk cahaya. Cahaya yang diemisikan memiliki panjang gelombang tertentu sesuai dengan perbedaan tingkat energi yang terlibat dalam proses emisi. Karena panjang gelombang emisi tertentu, maka berarti bahwa cahaya yang diemisikan akan memiliki warna tertentu.

C.   Hukum Dasar ( Hukum Lambert – Beer )

Bila ada seberkas cahaya melalui sebuah media yang transparant, maka bertambah turunnya intensitas cahaya yang diteruskan akan sebanding dengan bertambahnya kepekatan dan konsentrasi media. 

A = 3 c t

                        A : Absorbansi

                        Є : Koefisien Absorptivitas molar

                        C : Konsentrasi

                        t : Tebal media

Berdasarkan hukum Lambert Beer, bila cahaya monokromatik (Io) melalui suatu media (larutan), maka sebagian cahaya tersebut diserap (Ia), sebagian dipantulkan (Ir), dan sebagian lagi dipancarkan (It).

2. Prinsip Kerja Spektofotometri

            Spektrofotometer bekerja dengan cara mengukur jumlah relatif cahaya dari panjang gelombang yang berbeda yang diabsorbsi dan ditransmisikan oleh suatu senyawa. Gambar 1 menjelaskan mekanisme kerja spektrofotometer yang mana cahaya putih dibiaskan oleh prisma menjadi sejumlah cahaya dengan panjang gelombang yang berbeda. Cahaya tersebut akan melewati sampel dan kemudian melewati tabung/kuvet yang mengubah energi cahaya menjadi energi listrik yang digunakan untuk mengukur densitas sampel tersebut.

Gambar 1. Prinsip kerja spektrofotometer

            Teknik spektrofotometri dapat digunakan untuk menganalisi baik secara kuantitatif maupun secara kualitatif. Analisis secara kualitatif dilakukan dengan adanya pola spektrum yang mengenali suatu senyawa dan secara kuantitatif berdasarkan hukum Lambert-Beer. Hukum Lambert-Beer mengatakan bahwa intensitas suatu cahaya yang diserap berbanding lurus dengan konsentrasi senyawa. Semakin besar suatu konsentrasi, maka semakin besar nilai absorbasinya. Dengan adanya Hukum ini, maka dapat dirumuskan nilai absorbansi dengan persamaan: 

 

Keterangan :

A = Absorban

ε = koefisien ekstingsi molar 

b = tebal larutan (kuvet) 

c = konsentrasi larutan

3. Pemanfaatan Spektrofotometri

            Spektrofotometri digunakan sebagai salah satu metode dalam kimia analisis yang digunakan untuk menentukan komposisi suatu sampel baik secara kuantitatif dan kualitatif yang didasarkan pada interaksi antara materi dengan cahaya. Sedangkan peralatan yang digunakan dalam spektrofometri disebut spektrofotometer.

4. Jenis-Jenis Spektrofotometri

1. Spektrofotometer Visible (Spektro Vis)

Pada spektrofotometer ini yang digunakan sebagai sumber sinar/energi adalah cahaya tampak (visible). Cahaya visible termasuk spektrum elektromagnetik yang dapat ditangkap oleh mata manusia. Panjang gelombang sinar tampak adalah 380 sampai 750 nm. Sehingga semua sinar yang dapat dilihat oleh kita, entah itu putih, merah, biru, hijau, apapun.. selama ia dapat dilihat oleh mata, maka sinar tersebut termasuk ke dalam sinar tampak (visible).

Sumber sinar tampak yang umumnya dipakai pada spektro visible adalah lampu Tungsten. Tungsten yang dikenal juga dengan nama Wolfram merupakan unsur kimia dengan simbol W dan no atom 74. Tungsten mempunyai titik didih yang tertinggi (3422 ºC) dibanding logam lainnya. Karena sifat inilah maka ia digunakan sebagai sumber lampu. Sample yang dapat dianalisa dengan metode ini hanya sample yang memiliki warna. Hal ini menjadi kelemahan tersendiri dari metode spektrofotometri visible. Oleh karena itu, untuk sample yang tidak memiliki warna harus terlebih dulu dibuat berwarna dengan menggunakan reagent spesifik yang akan menghasilkan senyawa berwarna. Reagent yang digunakan harus betul-betul spesifik hanya bereaksi dengan analat yang akan dianalisa. Selain itu juga produk senyawa berwarna yang dihasilkan harus benar-benar stabil.

Salah satu contohnya adalah pada analisa kadar protein terlarut (soluble protein). Protein terlarut dalam larutan tidak memiliki warna. Oleh karena itu, larutan ini harus dibuat berwarna agar dapat dianalisa. Reagent yang biasa digunakan adalah reagent Folin.

Saat protein terlarut direaksikan dengan Folin dalam suasana sedikit basa, ikatan peptide pada protein akan membentuk senyawa kompleks yang berwarna biru yang dapat dideteksi pada panjang gelombang sekitar 578 nm. Semakin tinggi intensitas warna biru menandakan banyaknya senyawa kompleks yang terbentuk yang berarti semakin besar konsentrasi protein terlarut dalam sample.

2. Spektrofotometer UV (ultraviolet)

Berbeda dengan spektrofotometer visible, pada spektrofotometer UV berdasarkan interaksi sample dengan sinar UV. Sinar UV memiliki panjang gelombang 190-380 nm. Sebagai sumber sinar dapat digunakan lampu deuterium. Deuterium disebut juga heavy hidrogen. Dia merupakan isotop hidrogen yang stabil yang terdapat berlimpah di laut dan daratan. Inti atom deuterium mempunyai satu proton dan satu neutron, sementara hidrogen hanya memiliki satu proton dan tidak memiliki neutron. Nama deuterium diambil dari bahasa Yunani, deuteros, yang berarti ‘dua’, mengacu pada intinya yang memiliki dua pertikel. Karena sinar UV tidak dapat dideteksi oleh mata kita, maka senyawa yang dapat menyerap sinar ini terkadang merupakan senyawa yang tidak memiliki warna.

Oleh karena itu, sample tidak berwarna tidak perlu dibuat berwarna dengan penambahan reagent tertentu. Bahkan sample dapat langsung dianalisa meskipun tanpa preparasi. Namun perlu diingat, sample keruh tetap harus dibuat jernih dengan filtrasi atau centrifugasi. Prinsip dasar pada spektrofotometri adalah sample harus jernih dan larut sempurna. Tidak ada partikel koloid apalagi suspensi.

Sebagai contoh pada analisa protein terlarut (soluble protein). Jika menggunakan spektrofotometri visible, sample terlebih dulu dibuat berwarna dengan reagent Folin, maka bila menggunakan spektrofotometri UV, sample dapat langsung dianalisa. Ikatan peptide pada protein terlarut akan menyerap sinar UV pada panjang gelombang sekitar 280 nm. Sehingga semakin banyak sinar yang diserap sample (Absorbansi tinggi), maka konsentrasi protein terlarut semakin besar. Spektrofotometri UV memang lebih simple dan mudah dibanding spektrofotometri visible, terutama pada bagian preparasi sample.

Namun harus berhati-hati juga, karena banyak kemungkinan terjadi interferensi dari senyawa lain selain analat yang juga menyerap pada panjang gelombang UV. Hal ini berpotensi menimbulkan bias pada hasil analisa.

3.    Spektrofotometer UV-VIS

Spektrofotometer UV Vis merupakan alat yang terdiri dari dua komponen utama yaitu spectrometer dan fotometer. Spektrometer menghasilkan spectra dengan panjang gelombang tertentu, sedangkan fotometer merupakan alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau diabsorpsi. Jadi spektrofotometer digunakan untuk mengukur energi secara relatif bila energi tersebut ditransmisikan, direfleksikan, atau diemisikan sebagai fungsi dari panjang gelombang.

Kelebihan spektrometer dari fotometer adalah kemampuan alat tersebut untuk lebih menyeleksi panjang gelombang yang diinginkan dengan adanya alat pengurai seperti prisma, grating atau celah optis.

Berikut ini adalah diagram alat Spektrofotometer berkas tunggal

Bila seberkas sinar cahaya keluar dari sumber sinar, maka sinar akan masuk ke dalam sistem monokromator melalui slit. Monokromator akan menyeleksi panjang gelombang berkas sinar yang diinginkan untuk memasuki sel. Seleksi panjang gelombang dilakukan dengan memutar tombol panjang gelombang pada alat. Selanjutnya sinar yang monokromatis akan masuk melewati sel yang berisi larutan cuplikan. Sinar yang diteruskan selanjutnya akan masuk ke detector, dan sinyal detector akan disampaikan ke operator dalam bentuk read out.

S  Sumber Sinar

Sumber radiasi dalam spektrofotometri serapan mempunyai dua fungsi, pertama memberikan energi pada daerah panjang gelombang yang tepat untuk pengukuran, kedua untuk mempertahankan intensitas sinar yang tetap selama pengukuran. Untuk spektrofotometer sinar tampak ( Visible) digunakan lampu wolfram sebagai sumber sinar, lampu wolfram menghasilkan panjang gelombang > 375 nm. Sementara itu untuk spektrofotometer sinar UV digunakan lampu deuterium yang memiliki panjang gelombang di < 375 nm. Energi yang dipancarkan sumber sinar bervariasi sesuai dengan panjang gelombangnya.

S  Monokromator

Monokromator berfungsi untuk memperoleh sinar yang monokromatis, yaitu sinar dengan satu daerah panjang gelombang. Berikut adalah beberapa bagian dalam rangkaian monokromator:

·         Celah Masuk

Berfungsi mempersempit radiasi yang akan masuk dari sumber radiasi ke zat.

·         Lensa Kolimator

Berfungsi untuk mengubah sinar menjadi berkas sinar sejajar

·         Media Pendispersi

·         Celah Keluar

Berfungsi untuk mengisolasi sinar yang diinginkan dengan cara menghalangi sinar lain dan membiarkan sinar yang diinginkan lewat mencapai zat.

S  Sel (kuvet)

Sinar monokromatis yang keluar dari monokromator selanjutnya memasuki sel. Sel adalah tempat disimpannya larutan contoh yang akan diukur serapannya. Sel atau kuvet untuk tempat larutan diletakkan pada jalan cahaya dari monokromator. Pada saat cahaya monokromatis melalui sel, terjadi penyerapan sejumlah tertentu cahaya, sementara sebagian lain diteruskan ke detektor.

Kuvet untuk analisis harus memenuhi syarat-syarat sebagai berikut

ü  Tidak berwarna sehingga dapat mentransmisikan semua cahaya

ü  Permukaannya secara optis harus benar-benar sejajar

ü  Harus tahan /tidak bereaksi terhadap bahan-bahan kimia khususnya sampel yang akan diukur

ü  Tidak boleh rapuh

Bahan-bahan pada kuvet

o Kaca Silika Biasa     :           a. Tahan asam/ basa kuat

b. Tahan Pelarut Organik

c. Hanya untuk Visible

o Kuarsa                       :           a. Tahan asam/ basa kuat

b. Tahan Pelarut Organik

c. Untuk UV dan Visible

S  Detektor

Berfungsi untuk mengubah energi cahaya yang ditransmisikan atau diteruskan sel menjadi suatu besaran yang terukur. Pada umumnya mengubah energi cahaya menjadi energi listrik (arus listrik). Yang dapat dipakai sebagai detector adalah photo tube atau barrier layer cell yang keduanya dapat mengubah cahaya menjadi arus listrik (photo sensitive detector).

o   Photo Emmisive Cell(Foto tube)

Bentuk yang sederhana terdiri dari suatu bola gelas yang hampa udara atau berisi gas mulia pada tekanan rendah, misalnya argon pada 0,2 mmHg. Di dalam bola terdapat katoda yang berbentik lempeng setengah lingkaran dan bagian dalamya dilapisi zat yang sangat peka terhadap cahaya, misalnya campuran Caesium Oksida atau kalium oksida dengan perak oksida. Anoda yang terbuat dari cincin logam dan diletakkan sedikit dekat dengan pusat lingkaran. Anoda dan katoda dihubungkan dengan suatu baterai. Bila cahaya jatuh pada katoda, maka elektron dibebaskan dan meloncat ke anoda sehingga dalam sirkuit terdapat aliran elektron (timbul aliran listrik). Arus yang dihasilkan sangat lemah, karena itu dihubungkan dulu dengan amplifier sebelum dengan galvanometer. Skala dari galvanometer ditera dalam skala absorbans atau persen transmisi (%T).

o   Barrier layer cell

Terdiri dari sebuah plat logam yang dilapisi dengan suatu lapisan semi konduktor. Biasanya dipakai logam besi dengan lapisan semi konduktornya selen. Suatu lapisan transparan yang sangat tipis dari perak diletakkan di atas semi konduktor dan berlaku sebagai elektron kolektor. Energi cahaya yang jatuh di atas permukaan akan sampai ke semi konduktor dan mengeksitasi elektron-elektron pada antar permukaan perak-selen yang akhirnya menuju ke elektron kolektor, suatu daerah hypotical barrier terjadi diantara permukaan yang memudahkan elektron meninggalkan semi konduktor menuju ke elektron kolektor. Kekurangan elektron pada selen akan mengambil dari plat besi sehingga besi bermuatan positif sedangkan elektron kolektor bermuatan negatif, bila keduanya melalui suatu galvanometer, maka akan dihasilkan arus listrik.

S  Meter (Read Out)

Sinyal listrik yang dihasilkan pada detector dapat dibaca pada meter dengan mengkonversikannya ke dalam besaran absorbans atau %T.

Ada beberapa hal yang harus diperhatikan dalam analisis dengan spektrofotometri UV-Vis terutama untuk senyawa yang semula tidak berwarna yang akan dianalisis dengan spektrofotometri visibel karena senyawa tersebut harus diubah terlebih dahulu menjadi senyawa yang berwarna.

Berikut adalah tahapan-tahapan yang harus diperhatikan :

      Pembentukan molekul yang dapat menyerap sinar UV-Vis

Hal ini perlu dilakukan jika senyawa yang dianalisis tidak menyerap pada daerah tersebut. Cara yang digunakan adalah dengan merubah menjadi senyawa lain atau direaksikan dengan pereaksi tertentu. Pereaksi yang digunakan harus memenuhi beberapa persyaratan yaitu :

1.    Reaksinya selektif dan sensitif.

2.    Reaksinya cepat, kuantitatif, dan reprodusibel.

3.    Hasil reaksi stabil dalam jangka waktu yang lama.

4.    Waktu operasional

Cara ini biasa digunakan untuk pengukuran hasil reaksi atau pembentukan warna. Tujuannya adalah untuk mengetahui waktu pengukuran yang stabil. Waktu operasional ditentukan dengan mengukur hubungan antara waktu pengukuran dengan absorbansi larutan.

      Pemilihan panjang gelombang

Panjang gelombang yang digunakan untuk analisis kuantitatif adalah panjang gelombang yang mempunyai absorbansi maksimal. Ada beberapa alasan mengapa harus menggunakan panjang gelombang maksimal, yaitu :

1.    Pada panjang gelombang maksimal, kepekaannya juga maksimal karena pada panjang gelombang maksimal tersebut, perubahan absorbansi untuk setiap satuan konsentrasi adalah yang paling besar.

2.    Disekitar panjang gelombang maksimal, bentuk kurva absorbansi datar dan pada kondisi tersebut hukum    lambert-beer akan terpenuhi.

3.    Jika dilakukan pengukuran ulang maka kesalahan yang disebabkan oleh pemasangan ulang panjang gelombang akan kecil sekali, ketika digunakan panjang gelombang maksimal (Rohman, Abdul, 2007).

      Aplikasi Spektrofotometer UV-VIS

Analisis Kualitatif : dipakai untuk data sekunder atau data pendukung.

1.    Pemeriksaan kemurnian : dibandingkan dengan standar.

2.    Identifikasi : pengukuran  maks dan absorpsivitas molar.

3.    Elusidasi struktur : informasi adanya gugus kromofor dan gugus fungsi melalui profil spektrum

Analisis Kuantitatif

1.    Senyawa Tunggal : Dengan membandingkan absorban senyawa yang dianalisis dengan reference standard pada panjang gelombang maksimum.

2.    Senyawa multikomponen : mengukur absorban campuran pada panjang gelombang maksimum masing-masing

4.  Spektrofotometer Inframerah Transformasi Fourier

Pada dasarnya Spektrofotometer Fourier Transform Infra Red (disingkat FTIR) adalah sama dengan Spektrofotometer Infra Red dispersi, yang membedakannya adalah pengembangan pada sistim optiknya sebelum berkas sinar infra merah melewati contoh. Dasar pemikiran dari Spektrofotometer Fourier Transform Infra Red adalah dari persamaan gelombang yang dirumuskan oleh Jean Baptiste Joseph Fourier (1768-1830) seorang ahli matematika dari Perancis.

Dari deret Fourier tersebut intensitas gelombang dapat digambarkan sebagai daerah waktu atau daerah frekwensi. Perubahan gambaran intensitas gelobang radiasi elektromagnetik dari daerah waktu ke daerah frekwensi atau sebaliknya disebut Transformasi Fourier (Fourier Transform).

Selanjutnya pada sistim optik peralatan instrumen Fourier Transform Infra Red dipakai dasar daerah waktu yang non dispersif. Sebagai contoh aplikasi pemakaian gelombang radiasi elektromagnetik yang berdasarkan daerah waktu adalah interferometer yang dikemukakan oleh Albert Abraham Michelson (Jerman, 1831).

Cara Kerja Alat Spektrofotometer Fourier Transform Infra Red

Sistim optik Spektrofotometer Fourier Transform Infra Red ini dilengkapi dengan cermin yang bergerak tegak lurus dan cermin yang diam. Dengan demikian radiasi infra merah akan menimbulkan perbedaan jarak yang ditempuh menuju cermin yang bergerak ( M ) dan jarak cermin yang diam ( F ). Perbedaan jarak tempuh radiasi tersebut adalah 2 yang selanjutnya disebut sebagai retardasi ( δ ). Hubungan antara intensitas radiasi IR yang diterima detektor terhadap retardasi disebut sebagai interferogram. Sedangkan sistim optik dari Spektrofotometer Infra Red yang didasarkan atas bekerjanya interferometer disebut sebagai sistim optik Fourier Transform Infra Red.

Pada sistim optik Fourier Transform Infra Red digunakan radiasi LASER (Light Amplification by Stimulated Emmission of Radiation) yang berfungsi sebagai radiasi yang diinterferensikan dengan radiasi infra merah agar sinyal radiasi infra merah yang diterima oleh detektor secara utuh dan lebih baik.

Detektor yang digunakan dalam Spektrofotometer Fourier Transform Infra Red adalah Tetra Glycerine Sulphate (disingkat TGS) atau Mercury Cadmium Telluride (disingkat MCT). Detektor MCT lebih banyak digunakan karena memiliki beberapa kelebihan dibandingkan detektor TGS, yaitu memberikan respon yang lebih baik pada frekwensi modulasi tinggi, lebih sensitif, lebih cepat, tidak dipengaruhi oleh temperatur, sangat selektif terhadap energi vibrasi yang diterima dari radiasi infra merah.

Keunggulan Spektrofotometer Fourier Transform Infra Red

Secara keseluruhan, analisis menggunakan Spektrofotometer ini memiliki dua kelebihan utama dibandingkan metoda konvensional lainnya, yaitu :

·         Dapat digunakan pada semua frekwensi dari sumber cahaya secara simultan sehingga analisis dapat dilakukan lebih cepat daripada menggunakan cara sekuensial atau pemindaian.

·         Sensitifitas dari metoda Spektrofotometri Fourier Transform Infra Red lebih besar daripada cara dispersi, sebab radiasi yang masuk ke sistim detektor lebih banyak karena tanpa harus melalui celah.

5. Cara Penggunaan Spektrofotometer

a.    PC dan boot sistem operasi PC dinyalakan. Jika printer telah terhubung ke sistem, maka nyalakan printer.

b.    Dinyalakan spektrofotometer dan ditunggu sampai cahaya indikator spektrofotometer berwarna hijau. Proses ini meliputi pengujian spektrofotometer dan mengambil waktu sekitar 1 menit.

c.    Diletakkan sampel yang telah dimasukkan kedalam kuvet pada sample compartment. Sebelum sample di ukur, preparasi sample terlebih dahulu.

d.    Sistem siap untuk digunakan.

e.    Lampu hijau akan berkedip, hal ini menunjukkan bahwa pengukuran sedang berlangsung.

f.     Jika spektrofotometer berhenti, hal ini menunjukkan bahwa pengukuran telah siap berlangsung.

g.    Data  absorbansi dan spektrum akan terbaca di komputer, yang berbentuk grafik hubungan antara panjang gelombang dengan absorbansi.

6. Cara Perawatan Spektrofotometer

è Cara Perawatan dan Penyimpanan Alat :

1.    Sebelum digunakan, biarkan mesin warming-up selama 15-20 menit.

2.    Spektrofotometer sebisa mungkin tidak terpapar sinar matahari langsung, karena cahaya dari matahari akan dapat mengganggu pengukuran.

3.    Simpan spektrofotometer di dalam ruangan yang suhunya stabil dan diatas meja yang permanen.

4.    Pastikan kompartemen sampel bersih dari bekas sampel.

5.    Saat memasukkan kuvet, pastikan kuvet kering.

6.    Lakukan kalibrasi panjang gelombang dan absorban secara teratur.

è Hal-hal yang harus diperhatikan :

Ø  Larutan yang dianalisis merupakan larutan berwarna

                              Apabila larutan yang akan dianalisis merupakan larutan yang tidak berwarna, maka larutan tersebut harus diubah terlebih dahulu menjadi larutan yang berwarna. Kecuali apabila diukur dengan menggunakan lampu UV.

Ø  Panjang gelombang maksimum

            Panjang gelombang yang digunakan adalah panjang gelombang yang mempunyai absorbansi maksimal. Hal ini dikarenakan pada panajgn gelombang maksimal, kepekaannya juga maksimal karena pada panjang gelombang tersebut, perubahan absorbansi untuk tiap satuan konsentrasi adalah yang paling besar. Selain itu disekitar panjang gelombang maksimal, akan terbentuk kurva absorbansi yang datar sehingga hukum Lambert-Beer dapat terpenuhi. Dan apabila dilakukan pengukuran ulang, tingkat kesalahannya akan kecil sekali.

Ø  Kalibrasi Panjang gelombang dan Absorban

                              Spektrofotometer digunakan untuk mengukur intensitas cahaya yang dipancarkan dan cahaya yang diabsorbsi. Hal ini bergantung pada spektrum elektromagnetik yang diabsorb oleh benda. Tiap media akan menyerap cahaya pada panjang gelombang tertentu tergantung pada senyawa yang terbentuk. Oleh karena itu perlu dilakukan kalibrasi panjang gelombang dan absorban pada spektrofotometer agar pengukuran yang di dapatkan lebih teliti.

7. Cara Kalibrasi Spektrofotometer

Kalibrasi yang dimaksud ini adalah men-seting blank alat spektrofotometer, sebelum digunakan untuk analisis. Secara umum sbb:

1.    Nyalakan alat spektrofotometer

2.    Isi kuvet dengan larutan blanko (aquades)

3.    Diseting/diatur panjang gelombang untuk kalibrasi. Keterangan: 0%T itu diukur saat kuvet dalam keadaan kosong. 100%T itu diukur saat kuvet dalam keadaan terisi larutan.

4.    Kuvet berisi larutan blanko dimasukkan ke spektrofotometer

5.    lalu tekan tombol 0 ABS 100%T, tunggu sampai keluar kondisi setting blank (dalam bentuk teks)

    

Contoh tabel pengamatan absorbansi sebagai fungsi gelombang

dapus :

 Scribd.com